基因治疗载体AAV衣壳改造的研究进展

1. 自然发现

AAV 最初是作为细胞培养污染物被发现的，也是最广泛表征和使用的血清型 AAV2。值得注意的是，临床上最有希望的载体化血清型是那些从天然来源中分离出来的血清型。AAV9 最好地体现了这一概念，它是从人类肝脏组织中分离出来的。AAV9 是一种进化枝 F 血清型，显示出绕过血脑屏障 (BBB) 的能力，使其成为通过全身给药转导中枢神经系统 (CNS) 的主要衣壳。此外，最近受到广泛关注的从 CD34+ 人外周血造血干细胞中分离出来的进化枝F 衣壳，被证明具有无核酸酶基因编辑的能力。

流行病学分析表明，40-80% 的人群对 AAV抗体呈血清阳性，这表明由于预先存在的 AAV 衣壳免疫可能会降低转导效率，人源衣壳可能不是基因治疗载体的理想选择。血清流行病学和分子研究表明，AAV1、AAV2、AAV3、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8 和 AAV9 是人类的地方病。因此，从非人类来源分离衣壳可能会克服预先存在的免疫力。迄今为止，从非人灵长类（NHP）体内分离出的衣壳已显示出巨大的前景， NHP 衍生的 AAVrh.8、AAVrh.10 和 AAVrh.43（进化枝 E 衣壳；AAV8 也是一个成员）已被证明可以转导一系列组织。然而，根据地理抽样的不同，人群中抗 AAV8 中和抗体 (NAb) 的流行率为 10% 到 40%。其他进化枝 E 衣壳也有可能表现出反应性。

另外，许多研究现在都集中在从其他脊椎动物物种中分离出来的 AAV 衣壳的应用上。尽管这些衣壳在理论上引发患者预先存在的免疫反应的可能性最低，但它们在人类中也可能表现出较低的转导谱。值得注意的是，据报道，猪源性 rAAV 能够以与金标准 AAV 竞争的效率来转导小鼠器官。最有希望的是，猪 AAV 被证明不会被混合的人免疫球蛋白 G (IgG) 中和，并且具有转导成年小鼠大脑的能力，表明这些载体可以绕过血脑屏障（BBB）。

随着高通量测序方法的进步，天然衣壳多样性的发现变得简单。单分子实时 (SMRT) 测序等长读长测序技术允许对全长原病毒基因组进行测序，而无需进行序列重建。由于在个体患者的组织活检样本中观察到多种 AAV 血清型，因此该技术提供了观察由于几个 AAV 基因组之间自然重组而导致的变异的能力。

图2. AAV衣壳设计

2. 设计改造

2.1 AAV衣壳的合理设计

通过合理设计进行衣壳工程化，这种策略始于与细胞类型特异性受体结合的肽序列的简单嫁接。AAV 通过与初级受体和/或辅助受体结合而附着在细胞表面。一些 AAV 血清型的受体结合域已被鉴定，并且对 AAV 衣壳序列和结构的研究提供了有关 AAV 转导机制的详细信息。这些信息使得能够合理设计具有增强转导的 AAV 载体。例如，AAV1 和 AAV7 具有较高的肌肉趋向性，并且通过来自不同血清型（包括 AAV1、AAV2 和 AAV7）的衣壳的比对揭示了可能导致这种情况的几个保守氨基酸残基。研究中将 AAV1 的五个保守氨基酸残基移植到 AAV2 衣壳中产生的 AAV2.5 比 AAV2 更有效地转导肌肉。在杜氏肌营养不良症患者的临床试验中，将编码微型肌营养不良蛋白的 AAV2.5通过直接肌肉注射给药，验证了合理设计的 AAV 衣壳在临床研究中的实用性。这是临床使用的第一个合理设计的衣壳工程化AAV载体。此外，将来自 AAV9 衣壳中的半乳糖 (Gal) 结合基序移植到结合硫酸乙酰肝素的 AAV2衣壳上，产生的双聚糖结合嵌合型AAV株（AAV2G9），介导小鼠体内更快速、高效的基因表达。

另外，研究发现3 倍突起在塑造衣壳的趋向性和免疫原性方面起着重要作用，因此3 倍突起的暴露位置成为肽插入以增强受体结合的理想位置。这种方法不仅可以重新定位衣壳，而且还具有阻止免疫识别的能力。从黑猩猩组织中分离出天然 AAV9 衣壳变体，该变体与原型 AAV9 有四个残基不同，其中两个位于 3 倍突起处。将AAV9 衣壳上的这两个残基发生突变时获得的工程化衣壳载体——AAV9.HR，用其在新生小鼠血管内注射后保留了AAV9穿过 BBB 的能力，但其对外周组织的感染性有显著的下降。

通过合理设计改善载体转导的另一种方法是破坏衣壳的细胞降解。蛋白酶体抑制剂可以在体外和体内增强 AAV 转导，这表明修饰 AAV 衣壳以降低其泛素化可以使 AAV 病毒粒子避免蛋白酶体介导的细胞质降解。事实上，突变 AAV2 衣壳上暴露于表面的酪氨酸残基阻止了其磷酸化、随后的泛素化和蛋白酶体介导的降解。在小鼠肝脏中，这些修饰载体的转导比未修饰的 AAV2 高 10 倍以上。在其他血清型的衣壳上突变暴露于表面的酪氨酸残基也增强了不同动物模型中许多组织或细胞中的 AAV 转导。具有酪氨酸特异性突变的 AAV 血清型正在进入临床治疗，包括眼部疾病基因治疗 (ClinicalTrials.gov NCT02416622)。Luxturna 使用大约 40 年前开发的第一代 AAV2 载体，将这些研究的结果与使用 Luxturna 获得的结果进行比较应该会对后期应用有一定的参考意义。此外，修饰 AAV 衣壳上与泛素化相关的赖氨酸和丝氨酸残基也增强了转导。

图3.衣壳修饰的下一代重组 AAV载体的示意图

通过合理的设计也可用于生成具有新的转导特性的AAV衣壳，来将基因传递到通常不允许进行 AAV 转导的细胞中。例如，从噬菌体展示库中选择特定的细胞靶向肽并将其掺入 AAV 衣壳中以制造 AAV 突变体。然而，这种方法可能会改变病毒衣壳中肽的构象或阻止肽与靶细胞上的受体有效结合。因此还可以选择从随机 AAV 展示肽库中选择具有靶向性的衣壳变体。编码肽库的随机核酸序列，包括与靶细胞上的特定受体结合的那些，被插入到 AAV 衣壳基因组的允许位点，例如 AAV2 VP1氨基酸的 587 或 588位。源自这些突变体的 AAV 文库用于在 AAV 病毒粒子表面展示靶向肽。感染靶细胞后，AAV 突变体从特定组织或细胞中分离出来并进行表征。这种方法已被用于使用来自不同 AAV 血清型的模板分离对各种组织或细胞特异的 AAV 突变体。除了插入的肽之外，没有在AAV 衣壳中引入额外的突变；因此，使用随机肽库的方法被归类为合理设计。随着靶向肽在药物递送中的使用变得越来越流行，我们可以期待在各种 AAV 血清型的骨架中插入肽的应用会增加。

图4.AAV肽展示库原理

2.2 AAV 衣壳的定向进化

定向进化技术，包括易错 PCR、基因改组、蛋白质片段的靶向重组、合理设计和定向进化相结合的策略、基于 Cre 重组的 AAV 定向进化 (CREATE) 和体内定向进化，这些技术都已相继被用于开发新型AAV 载体。

易错 PCR 首先被用于将不同的点突变引入 AAV2 衣壳基因；在人胚胎肾 (HEK) 293 细胞中选择了具有不同特性的，例如增强转导的能力的AAV2 突变体。此外，还利用易错 PCR 建立了了 AAV9 突变文库，系统注射小鼠后，发现其中AAV9.45（携带 Asn498Tyr 和 Leu602Phe 突变）和 AAV9.61（携带 Asn498Ile 突变）能够有效转导外周组织，如心脏和骨骼肌，同时消除了对肝脏的靶向。

DNA 序列，尤其是那些连接衣壳可变区的序列，在 AAV 血清型和变体之间具有高度同源性。这些连接序列构成了基因改组的基础，这是 AAV 血清型之间同源重组的结果。Mark A Kay团队通过适应的 DNA 家族改组技术合并了多种天然 AAV 分离株的理想特性，从八种不同的野生型病毒创建了一个复杂的混合衣壳文库。在原代或转化人肝细胞中筛选获得了来自五种起始血清型的杂交库：2、4、5、8 和 9。使用混合的人抗血清（静脉内免疫球蛋白 [IVIG]）进行更严格的选择，然后选择了一个单一的 2型/8型/9型嵌合体，AAV-DJ。重组 AAV-DJ 载体在培养中的表现优于八种标准 AAV 血清型，并在幼稚和 IVIG 免疫的小鼠肝脏中的转导效率大大超过了AAV-2。

另有一种策略是结合了合理设计和定向进化来开发针对小鼠肝脏的新型 AAV 载体。以 AAV2 为模板，基于 150 个 AAV 血清型或变体的比对，对编码病毒体可变区氨基酸的 DNA 序列进行突变，以增加文库多样性。暴露在表面的残基也发生了突变：Tyr444 和 Tyr500 发生突变以减少蛋白酶体介导的病毒粒子降解，Arg585 和 Arg588 发生突变以消除病毒粒子与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合并增加 AAV2 与其他受体结合的机会。使用该文库的小鼠中进行筛选后，分离出一种含有Gly263Ala、Tyr500Phe、Thr503Pro 和 Lys507Thr 突变的 AAV2 衍生载体 (Li-C)；在小鼠肝脏中，Li-C 具有比 AAV2 更高的转导效率，并且与 AAV8 相当，这是转导小鼠肝脏最有效的 AAV 血清型。

尽管合理设计或定向进化可以产生转导增强的 AAV 载体，但由于血脑屏障和大脑中的细胞异质性，这些载体可能不会有效转导中枢神经系统。因此，研究者又基于CREATE 技术开发了具有大脑趋向性的 AAV 载体。CREATE 使用携带不同肽和 Cre 可逆开关的 AAV9 衣壳生成了 AAV 文库。在将病毒文库系统性注射到具有细胞类型特异性 Cre 表达的动物体内后，从成年小鼠的大脑中分离出AAV-PHP.B、AAV-PHP.eB 和 AAV-PHP.S突变体。AAV-PHP.B 将基因转移到小鼠CNS 的效率至少比当前野生型AAV9 高 40 倍。当与细胞类型特异性启动子一起使用时，这些 AAV突变体可在整个神经系统中提供靶向基因表达，并能够在整个转基因和非转基因动物的神经系统中进行高效和通用的基因操作。然而，这些高度进化的组织特异性和物种特异性 AAV 衣壳在人体可能表现出不同感染模式。

此外，研究者还利用体内定向进化分离了具有外层视网膜趋向性的 AAV 变体。这种 AAV 变体是使用三个不同的文库创建的，即一个易错的 AAV2 Y444F 文库，其中包含不同的点突变以及Tyr444Phe突变的AAV2 衣壳，一个 AAV 改组文库（来自 AAV 血清型 AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、 AAV8 和 AAV9) 和一个随机 7mer 插入文库，即AAV2 衣壳包含了随机插入的 7 个氨基酸序列。在将文库玻璃体内注射到小鼠体内后，从视网膜中分离出一种新的 AAV 变体 7m8，其中肽（LeuAlaLeuGlyGluThrThrArgPro）插入到 AAV2 衣壳 VP1 的残基 587 处，结果显示其可在小鼠和灵长类动物中有效地转导视网膜。可以说，使用定向进化分离的 AAV 突变体扩大了可用于未来临床试验的 AAV 载体库。

2.3 计算设计的AAV衣壳

使用计算设计生成具有增强转导的新衣壳变体，是利用 DNA 序列知识和 AAV 血清型之间的系统发育分析来构建潜在的祖先 AAV 衣壳文库。总共发现 AAV 血清型之间的 32 个可变位置适合生成祖先 AAV 衣壳库；这些衣壳在不同细胞系中具有与天然 AAV 血清型相似的转导效率，并且比 AAV1 更有效地转导小鼠肌肉。这些祖先的 AAV 也是热稳定的，不使用唾液酸、半乳糖或硫酸乙酰肝素蛋白聚糖作为结合受体，这表明它们可能通过与未修饰 AAV 载体不同的机制转导靶细胞。此外，从 75 个预选的 AAV 衣壳中鉴定了一个单一的祖先 AAV 载体（这些衣壳是通过整合当代 AAV 序列数据来预测 AAV 衣壳的假定祖先氨基酸序列来预选的），即 Anc80，它可以有效地转导成年小鼠和非人类灵长类动物的多个组织，包括肌肉、肝脏和视网膜。在一个Usher 综合征的小鼠模型中，Anc80 还可以转导整个耳蜗和前庭感觉器官而没有任何不良影响，并成功传递 USH1C（编码协调蛋白）以改善听力损失症状，包括部分恢复听觉功能、惊吓反应和平衡功能。

现代实验技术可以分析大量的生物序列，但工程蛋白质文库很少超过天然蛋白质家族的序列多样性。机器学习 (ML) 模型直接在没有生物物理建模的情况下根据实验数据训练，提供了一种获取工程蛋白质的全部潜在多样性的途径。哈佛医学院Eric D. Kelsic团队应用深度学习来设计高度多样化的AAV2衣壳蛋白变体，这些变体对于 DNA 有效载荷的包装仍然可行。专注于 28 个氨基酸的片段，生成了 wtAAV2的201,426 个变体，产生了 110,689 个可行的工程化衣壳，其中 57,348 个超过了天然 AAV 血清型序列的平均多样性。即使在有限数据上进行训练时，深度神经网络模型也能准确预测不同变体的衣壳活力。这种方法解锁了大量功能性但之前无法到达的序列空间，在产生改进的病毒载体和蛋白质疗法方面具有许多潜在的应用。

图5. 机器学习（ML）模型设计AAV衣壳

尽管 AAV 基因疗法在临床试验中显示出前景，但它仍面临着挑战，包括人体转导效率低于动物模型以及对 AAV的免疫反应等。工程化的 AAV 衣壳可以增加 AAV 的感染性并使病毒能够逃脱 NAb，因此，有可能克服这些障碍。然而，仍需关注的是，尽管已经在体外或动物模型中开发了工程化衣壳的 AAV 载体，但它们的优势可能不会转移到患者身上，正如在血友病临床中观察到的那样（超过七项临床试验目前仍在评估最佳的 AAV 介导的血友病患者体内递送方法）。无法在当前动物模型中重现数据促使我们开发新的系统，以更准确地预测人类靶组织中工程化 AAV 载体的转导效率。

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