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揭秘AAV：高分辨率冷冻电镜表征AAV载体结构

 
 
 

 

rAAV空壳病毒的产生与影响

在rAAV的生产过程中，病毒基因组进入细胞核中进行复制，经转录、翻译得到衣壳蛋白，并进行组装，随后在解旋酶复合物的介导下，核酸被引导并组装进入衣壳中，最终组装成完整的病毒颗粒（Full）。但在实际生产中，会产生多种类型的病毒颗粒，如完整病毒（衣壳中有完整的基因组）、部分包装病毒（包装了部分正确的DNA片段或者错误的DNA片段）、空壳病毒（衣壳内部没有DNA或者只有一些很小的DNA片段）、病毒聚集体、破损病毒等（见图1）[2] 。研究表明，这些空壳病毒和部分包装病毒会影响终产品的纯度，并可能降低病毒的转导效率，引发不必要的免疫反应，增加总体病毒载量[3] 。因此监管机构要求在整个生产过程中监控各类产品相关杂质，尤其是空壳AAV的比率。

 
 
 

rAAV载体空壳率的质控检测方法简介

为了保证AAV载体产品的有效性和安全性，对空壳病毒颗粒和完整病毒颗粒的比率进行快速准确的质控分析非常重要。目前rAAV载体空壳率分析的主流方法有分析性超速离心法（AUC）和冷冻电子显微镜法(Cryo-TEM)，其它方法还包括ddPCR-ELISA联用法、分子排阻-多角度激光散射法（SEC-MALS）等。
其中，AUC的原理是基于不同物质的沉降系数差异而在超速离心时将其分开，如完整AAV病毒颗粒和部分包装AAV病毒颗粒的沉降速度大于空壳AAV病毒颗粒，通过不同的沉降系数来区分不同的颗粒类型。AUC可测定空壳病毒颗粒、完整病毒颗粒和部分包装病毒颗粒的含量，同时也可检测病毒颗粒聚集体和病毒载体碎片等的相对含量。尽管功能强大，也存在一些局限性，如：
 

  1. 沉降系数只是颗粒的一个属性，不等同于颗粒类型，不同颗粒类型的沉降系数可能非常接近。例如在AUC检测中，完整病毒颗粒特征峰所对应的颗粒群体中可能包括多种颗粒类型，如真正的无损伤的完整病毒颗粒、局部变形的完整病毒颗粒、有一定破损的完整病毒颗粒、一定程度的寡聚物（如病毒碎片，或者病毒碎片与空壳颗粒形成的寡聚体），或其他质量和密度类似的杂质颗粒；

  2. 对样品要求较高，只能用于纯化样品的检测，样品浓度需高达5x10^12 VP/mL，样本量需500uL左右；

  3. 长时间离心过程中的机械剪切力可能会影响病毒结构，造成病毒颗粒变形、破损、聚集等，影响检测结果；

  4. AUC检测无法区分病毒聚集体中的空壳和实心颗粒，也无法区分一定程度的破损颗粒和空壳颗粒，及破损的完整病毒颗粒和无破损的完整病毒颗粒；

  5. 检测通量较低，单次运行约6个小时，分析3-7个样本，数据分析时间较长；

  6. 在GMP环境中实施AUC检测，需慎重评估离心过程中气溶胶带来的风险。

高分辨率冷冻电镜检测技术

实现单次表征多种属性

 
相比于其他技术，冷冻电镜检测技术是目前唯一一种可在近天然状态下对rAAV进行直观、快速的成像/检测技术，表征数据更具说服力，且适用于不同AAV工艺来源、具有不同浓度和纯度的各种血清型rAAV，对样品的需求量小（最低仅需3 ul）。
在冷冻电镜检测中，以天然状态存在于无定形的玻璃态冰层中的病毒衣壳内部的DNA含量与病毒颗粒图像的灰度值呈现直接对应关系，因此通过分析衣壳内部与衣壳之间的灰度差异，可以测定病毒衣壳内部DNA的填充程度——意味着该技术可以区分、并量化空壳病毒颗粒、部分包装病毒颗粒、和完整病毒颗粒的数量，及不同类型间的比例。通过冷冻电镜检测确定的完整病毒颗粒，不仅具有完整基因组，也保持了整体结构的完整性，相比其他检测技术确定的完整或实心病毒颗粒而言，更接近于原位的、真正能发挥功能的完整病毒颗粒。除了空壳率分析，冷冻电镜检测还可以同时提供病毒颗粒的形态、粒径、结构完整性、聚集程度等多个质量属性信息，并且可以进一步进行结构解析获取其原子水平的三维结构，用于促进表位分析和衣壳工程改造研究。
 
冷冻电镜技术具有良好的精密度和稳定性, 同时在GMP环境中也适用。并且具备仅需少量样本即可一次表征多种指标的优势，大大降低了检测成本。

 

 

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