如何用搅拌釜式一次性生物反应罐进行细胞高效放大培养
一为什么细胞放大培养如此重要?
生物工艺开发早期，通常是在小工作量的系统中进行的。这有助于节省时间和资源，因为在小规模的情况下，几个实验可以平行进行，培养基的成本很低，而且运行小型生物反应器所需的实验室空间也相对较少。但随着开发进程的推进，生物制药公司需要更多的材料来进行表征、试验和最终的商业化，它们需要过渡到实验规模，然后上升到中试/生产规模。这一过程中，保持恒定的产量和恒定的产品特性较为关键，这就需要在不同的尺度上重现细胞的生长环境。
二如何大规模化一种细胞培养的生物工艺？
在不同的规模上再现细胞的生长环境。在搅拌釜式生物反应罐中，各种参数定义了细胞的生长环境，如营养物的浓度和分布、溶解氧和二氧化碳的浓度以及机械应力。这些参数受生物反应罐的性能和设备的影响，如体积传质系数（kLa）、桨叶类型和充气装置，以及工艺参数如搅拌速度和气体流速等。
制定扩大规模的策略：放大规模时，保持其中一个工艺参数不变，往往将改变其他工艺参数。因此，只能部分重现细胞在不同规模下的生长环境。生物工程师必须确定影响细胞生长和生产力最大的参数，以决定哪种放大策略是最合适的。通常，科学家们决定在不同的规模上保持至少一个参数不变，比如：
▲ 桨叶叶尖线速度：它会影响培养物的混合，从而影响营养物质的分布和氧气的传递，但也会影响作用于细胞的剪切力。
▲ 功率输入/体积比(P/V)：它也会影响氧气传递和培养混合。
▲ 体积传质系数(kLa)：描述向生物反应器培养物输送氧气的效率。这取决于搅拌速度、桨叶类型、气体流速等参数。
有关这些参数、不同的放大策略及其利弊的更详细信息，请扫码访问我们的生物工艺知识中心的细胞放大页。
三搅拌釜式一次性生物反应罐的优点是什么?
目前，搅拌釜式生物反应罐是生物技术和制药工业中应用最广泛的生物反应器类型。其更易于工艺放大，因为搅拌釜式生物反应罐的设计更易采用经典工程方法进行描述 (如图 1)，而且这种生物反应器的设计，是被用于放大现象研究最多的。这种知识也被转移到一次性使用的技术中。
图 1：描述搅拌釜式生物反应罐几何形状的参数，包括桨叶直径(d)、生物反应罐内径(Di)、最大工作体积时液体高度(hVwmax)、生物反应罐高度(Hi)及其比值。
如今，在生物制品的开发和生产中，一次性生物反应罐通常比玻璃罐和不锈钢罐更受青睐，因为它们可以节省时间并降低风险，省去了费力的清洁程序，节省了时间，增加了周转时间，降低了交叉污染的风险。
BioBLU® c一次性生物反应罐
Eppendorf 的 BioBLU® c 一次性生物反应罐产品线将一次性生物反应罐技术的优点与传统玻璃罐或不锈钢罐的可靠性能和可扩展性相结合。BioBLU® 系列具有行业标准尺寸，支持高效的混合和传质，以及跨规模可重复的培养条件。
▲ 可扩展的设计，从 100mL 到 40L
▲ 刚性壁搅拌釜式设计，模仿了传统的生物反应罐
▲ 生物反应罐罐体和盖板由单层注塑成型塑料组成。原始原料：无使用回收材料的风险
Eppendorf一次性生物反应罐产品线
Eppendorf 生物工艺产品，提供全面的一次性解决方案，用于从 100mL 到 2000L 的细胞培养。
▲ BioBLU® c一次性生物反应罐，工作体积从 100 mL至40 L，与小规模和实验室规模的Eppendorf 生物反应起控制系统兼容。
▲ BioFlo® 720 生物反应控制系统，与 Thermo Scientific® HyPerforma® 一次性生物反应袋以及 BioBLU® 50c 一次性生物反应罐兼容
BioBLU® c 一次性生物反应罐的特性，适于简化细胞培养的放大工艺
当考虑如何放大细胞培养生物工艺时，研发科学家们通常决定在各个规模上保持一个参数恒定，比如叶尖线速度、kLa 或每体积的功率输入。
无论研发人员选择何种放大策略，都需要考虑两个重要因素。首先，不同尺寸的生物反应器的叶尖线速度范围、kLa 范围和 P/V 范围需要在一定程度上重叠，以便在不同尺寸上保持恒定。其次，需要获取一系列生物反应器工艺参数的信息来定义这种重叠。这就是为什么我们研究了 Eppendorf BioBLU® 一次性生物反应罐用于细胞培养应用的放大能力，以实现从小规模到中试规模的放大培养。
生物反应器的几何图形
从小规模到中试规模，BioBLU® 一次性生物反应罐在几何和比例上都采用类似的搅拌釜式设计(表 1)。
表 1：BioBLU® 一次性生物反应罐的几何形状。显示 BioBLU® 一次性生物反应罐和桨叶的放大相关几何参数。它证明了从小规模到中试规模的 BioBLU® 一次性生物反应罐在几何和比例上都有相似的搅拌釜式设计。
确定可扩展的叶尖线速度范围
叶尖线速度是细胞培养放大的一个重要参数。基于保持恒定叶尖线速度的放大是常见的策略之一，特别是对于对剪切力损伤敏感的培养物。我们确定 0.3 ~ 0.7 m/s 为 BioBLU® c 一次性生物反应罐的叶尖线速度可扩展范围，即所有 BioBLU® c 一次性生物反应罐可以达到的尖端速度范围(表 2)。
表 2：不同 BioBLU® 一次性生物反应罐桨叶顶部与搅拌速度的相关性计算公式如下：叶尖线速度(m/s) = π x 桨叶外径(m) x 搅拌速度(rps)
确定基于 kla 的可扩展范围
氧传递是生物反应罐中最关键的放大工艺参数之一，它可以用体积传质系数 kLa 来表示。当氧传递是细胞培养工艺的速率限制因素时，保持恒定的 kLa 可以实现从小规模到大规模的可扩展的产量。为了适当扩大细胞培养规模，选择具有相似 kLa 能力的不同尺寸的设备很重要，这些设备可以提供足够的参数重叠，以便小规模的成功可以在大规模中复制。
作为一个例子，我们使用静态放气法确定了不同尺寸的 BioBLU® c 一次性生物反应罐 (BioBLU 0.3c、3c 和 50c) 的 kLa[1]，并在 kLa 为 1 和 6 h-1 之间确定了一个基于 kLa 的可扩展范围 (图2)。所有 BioBLU® c 一次性生物反应罐都可以达到该范围内的 kLa 值，因此可以在不同的尺度上复制。
图 2：采用静态放气法测定了不同叶尖线速度和空气流速 (容器体积/分钟，VVM) 下的 BioBLU® 0.3c 开管通气式一次性生物反应罐、 BioBLU® 3c 大泡通气式一次性生物反应罐和 BioBLU® 50c 大泡通气式一次性生物反应罐 kLa 值[1]。我们在 kLa 为 1 到 6 h-1 之间确定了一个基于 kLa 的可扩展范围。所有经过测试的 BioBLU® c 一次性生物反应罐均可达到此范围内的 kLa 值。
确定基于 P/V 的可扩展范围
在生物反应罐之间保持恒定的每液体积桨叶功率消耗(P/V)是放大规模最普遍的策略之一。要计算它，需要桨叶功率数 Np (又称牛顿数 Ne)。Np 是与各类桨叶相关的无量纲数。然而，可测量的功率数因生物反应罐设置的各种因素而异。确定 Np 的工业标准方法是使用旋转扭矩传感器测量桨叶扭矩。
我们根据 DECHEMA® 推荐的操作步骤[1]确定了不同尺寸的 BioBLU® 一次性生物反应罐的功率 (表 1)。使用 Np 值，可以确定一个放大范围，在该范围内，通过应用生物反应罐技术规格范围内的叶尖线速度，可以通过感兴趣的生物反应罐类型实现 P/V 值。图 3 举例显示了 BioBLU® 0.3c，3c 和 50c 一次性生物反应罐的 P/V 和叶尖线速度的相关性。
图 3：生物反应罐功率数是根据 DECHEMA 建议[1]测量的，总结如下。P/V 的计算公式为 P/V [W/m3] =(桨叶功率数× DI 水密度[kg/m3] ×搅拌速度[rps] 3 ×桨叶外径[m]5)/满载工作体积[m3]。为了测量功率数，对生物反应罐进行了改造，将磁体从磁力驱动联轴器上移除，并将扭矩传感器通过改造后的头板使用定制适配器连接在电机和桨叶轴之间。所有数据均在单桨叶、顺时针搅拌/向上流动的标准生物反应罐上收集；容器中充满去离子水，使其达到最大工作容积。包括自重扭矩在内的所有数据，平均每次测量 300 个读数。在不加气的情况下，以每个叶尖线速度重复测量桨叶扭矩 5 次。数据采集在 24.5℃ 环境温度下进行。功率数字是平均两个 BioBLU® 一次性生物反应罐的每个尺寸。
成功案例：利用一次性生物反应罐扩大细胞培养规模
在一次概念验证研究中，我们开发了 CHO 细胞放大培养的工作流程，在从实验室到中试生产规模的所有阶段使用一次性生物反应罐。对于放大策略，我们选择保持恒定的 P/V。为了简化细胞放大培养工艺，我们使用了 Eppendorf 的 BioFlo® 320 和 BioFlo® 720 生物反应控制系统的“Scale Up Assist（放大辅助系统）”的软件功能。
Scale Up Assist 软件功能，
简化细胞放大培养
P/V 和叶尖线转速都依赖于搅拌速度。在将生物工艺转移到不同尺寸的生物反应罐时，为了保持 P/V 或叶尖线速度恒定，需要相应地调整搅拌速度。Eppendorf 的 Scale Up Assist 软件(图 4)功能简化了这一过程，该软件自动填充功率数和桨叶直径的各种生物反应罐类型。科学家们只需要从列表中选择所用的生物反应罐类型，并输入工作体积。然后，该软件自动计算出搅拌速度，其结果是以指定的P/V值或叶尖速度在选定的工作体积下工作。Scale Up Assist 是 Eppendorf BioFlo® 320 和 BioFlo® 720 生物反应罐控制系统的软件功能。
比较 3L 和 150L 体积下的
细胞生长和抗体产生
在 BioFlo® 320 和 BioFlo® 720 生物反应控制系统下，我们将 CHO 细胞培养生物工艺从 3 L 扩大到 10 L，在 BioBLU® 一次性生物反应罐中进一步扩大到 40 L 和 150 L。通过使用 Scale Up Assist 功能计算的参数和应用说明中详细描述的参数，我们可以在 3 L 到 150 L 工作体积之间、多个批次运行中匹配其生长曲线。当运行完成时，所有的 IgG 产量相近。
